Fit fürs Labor

Philip Bonner ist Programmleiter für den Masterstudiengang “Applied Biosciences” am Zentrum für Biomedizinische Wissenschaften der Nottingham Trent University (UK). Er verfügt über jahrzehntelange Erfahrung in der Aufreinigung von Proteinen und Peptiden und in der Enzymologie. Alan Hargreaves ist Dozent an der Nottingham Trent University (UK). Er ist dort verantwortlich für das Master-Modul Zellkultur und Antikörpertechnologie und unterrichtet in mehreren weiteren Modulen, darunter Forschungsmethoden und Bioethik, Toxikologie, Biochemische Techniken und Neurowissenschaften.

• vorwort vGlossar xvAbkürzungen xxiii1 Herstellung von Lösungen in der biowissenschaftlichen Forschung 11.1 Einführung 11.2 Konzentration 21.2.1 Molarität 21.3 Verwendung einer Waage zum Einwiegen von Reagenzien 31.3.1 Verwendung einer elektronischen Waage 31.3.2 Verwendung einer Präzisionswaage 51.3.3 Verwendung einer Analysenwaage 51.4 Praktische Überlegungen bei der Herstellung einer einmolaren Lösung (1,0 M) 61.4.1 Herstellung von Lösungen mit einer Konzentration von weniger als 1,0 M und einem Volumen von weniger als einem Liter 71.4.2 Herstellen von molaren Flüssigkeitslösungen 91.4.3 Herstellen von prozentualen Lösungen 111.4.3.1 Einwiegen in Volumen-Lösungen (w/v) 121.5 Verdünnungen und die Verwendung von Pipetten 121.5.1 Verwendung von zylindrischen Glas- oder Kunststoffpipetten mit Skala 141.5.2 Verwendung von Handmikropipetten 151.5.3 Verdünnung aus einer Stammlösung 171.6 Wasser, Säuren und Basen 181.6.1 Wasser als Lösungsmittel 191.6.2 Ionisierung von Wasser 201.6.3 Säuren und Basen 211.6.3.1 Starke und schwache Säuren 221.7 Puffer 221.7.1 Herstellung eines Puffers und Verwendung eines pH-Messgeräts 231.8 Gleichgewichts-/Dissoziationskonstante (K a) für eine Säure oder Base 251.8.1 Henderson-Hasselbalch-Gleichung 261.9 Zusammenfassung 271.9.1 Hinweise 272 Mikroskopie 292.1 Einführung 292.2 Mikroskope – Allgemeine Grundsätze 312.3 Prinzipien der Bilderzeugung 322.3.1 Maßeinheiten 322.4 Lichtmikroskopie 342.4.1 Hellfeldmikroskopie 342.4.1.1 Probenpräparation 352.4.1.2 Gram-Färbung für Bakterien 372.4.1.3 Hämatoxylin/Eosin-Färbung von Paraffin-Wachsschnitten 382.4.2 Phasenkontrastmikroskopie 392.4.3 Differentialinterferenzkontrast 392.4.4 Fluoreszenzmikroskopie 402.4.5 Verwendung eines Lichtmikroskops 432.4.5.1 Allgemeine Merkmale von Mikroskopen 432.4.5.2 Fokussieren einer Probe 442.4.6 Datenanalyse und -Präsentation 462.4.6.1 Zeichnen und Beschriften eines Mikroskopbilds 462.4.6.2 Größenmessungen mit einem Lichtmikroskop 472.4.6.3 Quantifizierung bestimmter Merkmale in mikroskopischen Proben 482.4.6.4 Anwendung der Mikroskopie bei der Zellzählung 492.5 Elektronenmikroskopie 512.6 Zusammenfassung 543 Spektralphotometrie 573.1 Einführung 573.2 Elektromagnetisches Spektrum 573.3 Absorption von Licht 603.3.1 Fluoreszenz 603.3.2 Lumineszenz 613.4 UV/VIS-Spektralphotometrie 623.5 Gesetzmäßigkeiten der Lichtabsorption 633.5.1 Lichtabschwächung (optische Dichte) 643.6 Lambert-Beersches Gesetz 643.6.1 Beschränkungen des Lambert-Beerschen Gesetzes 663.7 Spektralphotometer 673.7.1 Einführung 673.7.2 Lichtquelle 693.7.3 Optik zur Erzeugung der Lichtwellenlängen 693.7.4 Spaltbreite 693.7.5 Küvette 703.7.6 Detektor 723.7.7 Verwendung von Mikroplatten-Lesegeräten 723.7.7.1 Hochdurchsatz-Screening (HTS) 743.8 Anwendungen der Spektralphotometrie in den Biowissenschaften 763.8.1 Direkte Messungen von biologischen Molekülen 763.8.2 Chromophor-Assays 773.8.3 Enzymatisch katalysierte Reaktion 793.9 Zusammenfassung 863.9.1 Hinweise 864 Datenanalyse und Präsentation 874.1 Einführung 874.2 Statistische Datenanalyse: Wichtige Definitionen 894.2.1 Populationen und Stichproben 894.2.2 Variablen und Beobachtungen 894.2.3 Deskriptive Statistik 904.2.4 Messungen zur Streuung (Dispersion) 914.3 Verteilungen 934.3.1 Normalverteilung 934.3.2 Asymmetrische (nicht normale) Verteilung 974.3.3 Diskrete Wahrscheinlichkeitsverteilungen 974.4 Statistischer Datenvergleich 984.4.1 Vergleich von zwei Gruppen von Werten 994.4.1.1 Ungepaarte und gepaarte parametrische Tests (t-Tests) 994.4.2 Ungepaarte und gepaarte nicht parametrische Tests 1024.4.3 Vergleiche von mehreren Datensätzen 1034.4.4 Chi-Quadrat-Test für dichotome Variablen 1044.4.5 Analyse der Beziehungen zwischen zwei Variablen: Lineare Korrelation und Regression 1044.5 Darstellung, Struktur und Organisation von Daten in Laborberichten 1084.5.1 Präsentation der Daten 1094.5.2 Inhalt 1124.5.2.1 Einführung 1124.5.2.2 Ziele 1124.5.2.3 Ergebnisse 1124.5.2.4 Diskussion 1124.5.2.5 Literaturangaben 1134.5.3 Artikel in Journalen 1134.5.4 Artikel in Büchern 1144.5.5 Software zur Verwaltung von Literaturangaben 1144.6 Zusammenfassung 1145 Extraktion und Klärung von biologischen Stoffen 1175.1 Einführung 1175.2 Extraktion 1175.2.1 Proteine 1175.2.2 Desoxyribonukleinsäure 1185.2.3 Lipide 1195.2.4 Organellen 1195.3 Extraktionsmethoden für tierisches und pflanzliches Gewebe 1205.3.1 Mörser und Stößel 1205.3.2 Homogenisatoren und Gewebemühlen 1205.3.3 Mixer 1215.4 Extraktionsmethoden für Bakterien 1215.5 Klärung 1235.5.1 Einführung in die Zentrifugation 1235.5.2 Zentrifugen 1265.5.3 Zentrifugenrotoren 1275.5.4 Zentrifugenröhrchen 1295.6 Zentrifugationstechniken 1305.6.1 Differentialzentrifugation 1305.6.2 Dichtegradientenzentrifugation 1325.6.3 Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation 1325.7 Gute Praktiken bei der Zentrifugation 1335.8 Zusammenfassung 1345.8.1 Hinweise 1356 Elektrophorese von Proteinen und Nukleinsäuren 1376.1 Allgemeine Einführung 1376.2 Separation von Proteingemischen durch Gel-Elektrophorese 1386.2.1 Herstellung von Elektrophoresegelen 1386.2.2 Probenvorbereitung und Beladung 1426.2.3 Ablauf der Elektrophorese 1446.2.4 Praktische Hinweise und Tipps für die SDS-PAGE 1486.2.4.1 Probenvorbereitung 1486.2.4.2 Gelvorbereitung 1496.2.4.3 Auftragen der Probe 1496.2.4.4 Achtsamkeit während der Elektrophorese 1506.2.4.5 Entfernung des Gels und Handhabung 1506.2.4.6 Datenanalyse 1516.2.4.7 Auswertung 1516.3 Weitere Elektrophoresetechniken für Proteine 1526.3.1 Nicht denaturierende (native) Gelelektrophorese 1526.3.1.1 Andere Anwendungen von nicht denaturierender PAGE: In-situ- Detektion von Enzymaktivität 1546.3.2 Celluloseacetatfolien-Elektrophorese 1566.3.3 Western Blotting 1566.3.4 Isoelektrische Fokussierung (IEF) und zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE) 1566.4 Trennung von Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese 1586.4.1 Probenvorbereitung 1596.4.2 Vorbereitung und Anwendung von Agarosegelen 1596.4.3 Färben von Gelen zum Nachweis von Nukleinsäuren 1606.5 Anwendungen der Nukleinsäure-Gelelektrophorese 1616.5.1 DNA-Fingerabdruck und PCR 1616.5.2 RNA-Analyse 1616.5.3 Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) 1626.5.4 Identifizierung spezifischer Sequenzen mithilfe von Hybridisierungstechniken 1636.5.5 DNA-Sequenzierung 1646.6 Zusammenfassung 1657 Chromatographie 1677.1 Einführung 1677.2 Theorie der Chromatographie 1677.2.1 Verteilungskoeffizient (KD) in der Chromatographie 1697.3 Bei der Chromatographie zu berücksichtigende Faktoren 1727.4 Methoden zur Probenelution in der Chromatographie 1747.5 Auswahl von Methoden, die zum Pufferaustausch und zur Probenkonzentrierung vor der Chromatographie verwendet werden können 1767.5.1 Dialyse 1767.5.2 Größenausschlusschromatographie (auch Gel-Permeations- Chromatographie, GPC) 1787.5.3 Ultrafiltration 1787.5.4 Zentrifugalverdampfer 1807.5.5 Lyophilisierung (Gefriertrocknung) 1817.6 Vakuumpumpen 1827.7 Verschiedene Chromatographie-Arten und Eigenschaften, die zur Trennung von Molekülen genutzt werden 1827.7.1 Adsorptionschromatographie 1827.7.2 Verteilungschromatographie 1837.7.3 Ionenaustauschchromatographie 1837.7.4 Größenausschlusschromatographie (SEC) (auch Gel-Permeations- Chromatographie (GPC) 1847.7.5 Affinitätschromatographie 1847.8 Dünnschichtchromatographie (TLC) 1857.9 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) 1867.9.1 Normalphasenchromatographie (NP), Umkehrphasenchromatographie (RP), Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) und Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) 1897.10 Gaschromatographie (GC) 1917.11 Ionenaustauschchromatographie (IEX) 1927.11.1 Antikörperaufreinigung 1947.12 Größenausschlusschromatographie (SEC) (auch Gel-Permeations-Chromatographie, GPC) 1967.13 Affinitätschromatographie 1987.14 Zusammenfassung 1997.14.1 Hinweise 1998 Zellkulturtechniken 2018.1 Einführung 2018.2 Wachstum und Pflege von Zellkulturen 2068.2.1 Feste Nährmedien 2078.2.1.1 Verdünnungsausstrich 2078.2.1.2 Verdünnung mit Ausbreitungsplatte 2108.2.1.3 Verdünnung mit Gussplatte 2128.2.2 Weitere Anwendungen von Kulturmethoden in festen Nährmedien 2128.2.2.1 Bakteriophagen-Nachweis 2128.2.2.2 Pflanzliche Gewebekultur 2148.2.3 Flüssige Nährmedien 2168.2.3.1 Zellsuspensionskulturen 2168.2.3.2 Alternativen zur Batch-Kultur 2178.2.4 Flüssigkultur von eukaryotischen Zellen 2198.2.4.1 Suspensionskultur 2198.2.4.2 Monolayer-Kultur von Säugetierzellen 2208.2.5 Zellaussaat für Experimente 2218.2.6 Kryokonservierung von Zellen 2228.3 Zusammenfassung 2248.3.1 Hinweis 2249 Antikörper-basierte Assays (Immunassays) 2259.1 Struktur und Verwendung von Antikörpern 2259.2 Reinigung, Markierung und Nachweis von Antikörpern 2279.3 Immunassay-Methoden 2319.3.1 Kompetitive Assays 2319.3.1.1 Wichtige Schritte bei kompetitiven Immunassays 2329.3.2 Nicht kompetitive Immunassays 2389.3.2.1 Indirekter ELISA-Test (eine Stelle) 2389.3.2.2 Sandwich-ELISA (zwei Bindungsstellen) 2429.3.2.3 Immunblot 2439.3.2.4 Dot Blot 2449.3.2.5 Western Blot 2459.3.2.6 Immunzytochemische und immunhistochemische Färbung 2469.4 Kontrollen 2509.5 Zusammenfassung 250Vorschläge für weiterführende Literatur 251Stichwortverzeichnis 255