Der HPLC-Experte II

Stavros Kromidas wurde nach langjähriger Tätigkeit im Verkauf von Waters Chromatography Inhaber und Geschäftsführer der Novia GmbH, später selbständiger Berater. Der promovierte Chemiker arbeitet seit 1978 auf dem Gebiet der HPLC und hat seit 1984 zahlreiche Trainingskurse und Workshops geleitet. Er ist Autor einer regelmäßigen HPLC-Kolumne in der Zeitschrift „Labo“ sowie einer Reihe außerordentlich erfolgreicher Bücher.

• Vorwort xiiiZum Aufbau des Buches xvBeitragsautoren xvii1 Wann sollte ich meine UHPLC als UHPLC betreiben? 1S. Kromidas1.1 Was möchte ich erreichen und was „kann“ die UHPLC? 11.2 Anforderungen an eine HPLC-Methode 31.2.1 Gut trennen 31.2.2 Schnell trennen 131.2.3 Massenempfindlichkeit verbessern (konstantes Injektionsvolumen) 151.2.4 Robuste Trennungen gewährleisten 171.3 Die UHPLC im Alltag 191.4 Wie kann das Potenzial der UHPLC tatsächlich ausgeschöpft werden? 231.5 Zusammenfassung und Ausblick 26Literatur 29Teil 1 Hardware/Software Spezifika, Trennmodi, Materialien 312 Die moderne HPLC-/UHPLC-Anlage 332.1 Heutige Anforderungen an die einzelnen Module 33S. Wiese2.1.1 Überblick 332.1.2 UHPLC-Pumpentechnik 342.1.3 Autosampler 412.1.4 Säulenofen 472.1.5 Detektoren 502.1.6 Kapillaren/Verschraubungen 53Literatur 572.2 Der Säulenofen – eine einfache Angelegenheit? 59M. Heidorn und F. Steiner2.2.1 Thermische Betriebsweisen von Säulenöfen 622.2.2 Temperaturunterschiede zwischen mobiler Phase und LC-Säule 642.2.3 Reibungswärme – nur ein Phänomen der UHPLC? 692.2.4 Thermostatisierung in der Methodenübertragung 76Literatur 793 Das Problem der externen Bandenverbreiterung in einer HPLC-/UHPLC-Anlage 81M. Dittmann3.1 Theoretischer Hintergrund 833.1.1 Effizienz und Peakauflösung moderner UHPLC-Säulen 833.1.2 Bestimmung der Peakvolumina 853.2 Externe Bandenverbreiterung in UHPLC-Systemen 873.2.1 Die Ursachen externer Bandenverbreiterung in HPLC-/UHPLC-Systemen 873.2.2 Experimentelle Bestimmung der externen Bandenverbreiterung 973.3 Auswirkung externer Bandenverbreiterung in verschiedenen Applikationsbereichen 1003.3.1 Einfluss auf isokratische Trennungen 1003.3.2 Auswirkungen auf Gradiententrennungen 1003.4 Optimierung des HPLC-/UHPLC-Systems 1043.4.1 Test der Säuleneffizienz 1053.4.2 Andere isokratische Trennungen 1053.4.3 Hochauflösende Gradiententrennungen 1063.4.4 Schnelle Gradiententrennungen 1063.5 Zusammenfassung 107Literatur 1084 Der Gradient – Anforderungen, optimaler Einsatz, Tricks und Fallstricke 111F. Steiner und M. Heidorn4.1 Apparative Einflüsse bei der Gradientenelution – ein Überblick 1114.1.1 Gradientenverweilvolumen oder Gradientenverzögerungsvolumen 1114.1.2 Rolle des Gradientenmischers 1134.1.3 Auf physikalisch-chemischen Phänomenen beruhende Unterschiede zwischen Gradientenpumpentypen 1154.1.4 Apparative Einflüsse außerhalb der Pumpe 1214.1.5 Belastung und Abnutzung von Säulen bei Gradientenmethoden 1244.2 Technische Umsetzung und Charakterisierung von Gradienten- Hplc 1254.2.1 Wissenswertes und Grundlegendes zum Einfluss der bei Gradientenpumpen angewandten Förderund Dosierungstechniken 1264.2.2 Notwendigkeit der Entgasung der Laufmittelkomponenten 1284.2.3 Verschiedene Pumpentypen (seriell, parallel, Nockenantrieb, Spindelantrieb) und ihre Spezifika 1304.2.4 Auswirkungen der Pumpenbauart auf die Anwendung im Gradienten 1344.2.5 Auswirkungen der Arbeitszyklen auf die Chromatographie und notwendige Abstimmungen bei HPG-Anlagen 1354.2.6 Auswirkungen der Arbeitszyklen auf die Chromatographie und notwendige Abstimmungen bei LPG-Anlagen – eine gänzlich verschiedene Problematik 1394.2.7 Thermische Effekte in einer Gradientenpumpe und ihre Auswirkungen 1414.2.8 Methoden mit besonders steilen (ballistischen) Gradienten 1424.2.9 Grundsätzliches zur Bestimmung des Gradientenverweilvolumens einer Apparatur 1494.2.10 Die Markerpulsmethode als eine quick-and-dirty Lösung 1504.2.11 Die Dolan-Methode – ein Klassiker und seine Varianten 1524.2.12 Wie eine effektive Mischung bei einem angemessenen GDV technisch erreicht werden kann 1544.2.13 Charakterisierung der Mischungseffizienz und Gradientenformung einer Apparatur 1604.2.14 Richtiges Mischervolumen in Abhängigkeit von Pumpentyp, Flussrate und Applikation am Beispiel von TFA-Gradienten 1664.2.15 Gradientenmischung und die Besonderheiten bei der Elution von Proteinen 173Literatur 1745 Anforderungen bei der (U)HPLC-Kopplung mit unterschiedlichen Massenspektrometern 175T. Teutenberg, T. Hetzel, C. Portner und J. Türk5.1 Einleitung 1755.2 Von der Target-Analytik zu Screeninguntersuchungen 1765.2.1 Target-Analytik 1765.2.2 Suspected-Target Screening 1765.2.3 Non-Target Screening 1775.3 Was ist bei der Kopplung von UHPLC und MS zu beachten? 1785.3.1 DasInterfaceunddieoptimaleFlussrate 1785.3.2 Optimierung der massenspektrometrischen Parameter 1795.3.3 Optimierung der chromatographischen Parameter 1795.3.4 Auswahl der geeigneten Säule und Säulengeometrie 1815.4 Target-Analytik mittels Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie 1845.5 Screening mittels LC-MS 1925.6 Miniaturisierung – LC-MS quo vadis? 197Literatur 2016 2D-Chromatographie – Möglichkeiten und Grenzen 203T. Teutenberg6.1 Einführung – warum zweidimensionale HPLC? 2036.2 Peakkapazität ein- und zweidimensionaler HPLC-Verfahren 2056.2.1 Peakkapazität eindimensionaler Trennverfahren 2056.2.2 Peakkapazität zweidimensionaler Trennverfahren 2066.3 Modulation 2106.3.1 Online Heart-Cut 2D LC 2106.3.2 Umfassende Online 2D LC 2116.3.3 Stop-Flow und Offline LC × LC 2136.4 Praktische Probleme der online LC × LC 2146.4.1 Kompatibilität der Lösemittelsysteme 2146.4.2 Verdünnung 2146.4.3 Hohe Flussraten 2146.4.4 Kompatibilität mit Massenspektrometrie 2156.5 Realisierung eines miniaturisierten LC × LC-Systemaufbaus 2156.5.1 Technische Plattform 2156.5.2 Auswahl der stationären Phasen 2166.5.3 Auswahl der mobilen Phase und Temperatur 2176.5.4 Säulengeometrie und Modulation 2176.5.5 Gradientenprogrammierung und Gesamtanalysenzeit 2186.5.6 Kopplung mit Massenspektrometer 2186.6 Applikationsbeispiel 2196.6.1 Messung eines Referenzstandards 2196.6.2 Messung einer Realprobe 2216.7 Vorteile der MS/MS-Funktionalität 2226.8 Offline LC × LC versus Online LC × LC 2236.9 Lösungen der Gerätehersteller (in alphabetischer Reihenfolge) 2266.9.1 Kommerziell verfügbare Gesamtlösungen für die LC × LC 2276.9.2 Weitere Systemlösungen 2286.10 2D-LC – quo vadis? 2286.10.1 Software 2286.10.2 Systemkonfektionierung 2296.10.3 Peakkapazität versus Realprobe 2296.11 Abschließende Bemerkungen 230Literatur 2317 Materialien in HPLC und UHPLC – was für welchen Zweck? 233Tobias Fehrenbach und Steffen Wiese7.1 Abkürzungsverzeichnis 2337.2 Überblick 2347.3 Anforderungen an Materialien einer UHPLC 2357.3.1 Mechanische Beständigkeit 2367.3.2 Chemische Beständigkeit 2367.3.3 Kompatibilität zum Analyten/Biokompatibilität 2377.4 Flusswege in einem UHPLC-System 2387.4.1 Niederdruck- und Hochdruckflussweg 2387.4.2 Flussweg der mobilen Phase und der Probe 2397.5 Niederdruckflussweg 2407.6 Hochdruckflussweg 2427.6.1 Pumpe 2427.6.2 Autosampler 2497.6.3 Kapillaren und Verschraubungen 2557.7 Wann und warum kann ein inertes UHPLC-System erforderlich sein? 2607.7.1 Begriff der Inertheit 2617.7.2 Natur der Passivschicht 2627.7.3 Anforderungen und Wechselwirkungen 2667.7.4 Passivierungsstrategien und -methoden 272Literatur 275Teil 2 Erfahrungsberichte, Trends 2818 Wasmussdie Software können, damitdie Hardware optimal genutzt werden kann? 283A. Simon8.1 Einführung 2838.2 Funktionalität und Bedienung 2848.3 Integration 2848.4 Gerätesteuerung 2858.5 Bedienung 2868.6 Ease of Use 2878.7 Bedienoberflächen 2888.8 Multilingual 2898.9 Austausch von Daten 2908.10 Datenimport und -export 2918.11 Skalierbarkeit vom PC bis zur globalen Installation 2929 Aspekte der modernen HPLC – Erfahrungsbericht eines Anwenders 295Steffen Wiese9.1 Einführung 2959.2 Bestimmung des Gradientenverweilvolumens 2959.3 Hochdurchsatztrennung (High Throughput Separations) 2999.4 Methodentransfer zwischen UHPLC-Systemen unterschiedlicher Hersteller 3029.5 Anwendung höherer Temperaturen 3059.6 Injektion großer Volumina (Large Volume Injection, LVI) 3079.7 UHPLC-Trennungen mit 1 mm Innendurchmesser Säulen 312Literatur 31510 Erfahrungsbericht eines unabhängigen Serviceingenieurs – Tipps und Empfehlungen für einen optimalen Betrieb von Agilent- und Waters-Anlagen im Alltag 317S. Chroustovsky10.1 Einleitung 31710.2 Der Degasser, Prinzipien 31710.2.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 31810.3 Die Pumpe, Prinzipien 31910.3.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 32110.4 Autosampler, Prinzipien 32210.4.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 32410.5 Die UV-Detektoren, Prinzipien 32510.5.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 32611 Der Analyt, die Fragestellung und die UHPLC – der Einsatz von UHPLC in der Praxis 329S. Lamotte11.1 Einleitung 32911.2 Wann ist der Einsatz von UHPLC sinnvoll und wann eher nicht? 32911.3 Freisetzungstests in der pharmazeutischen Industrie 33111.4 Methodenentwicklung und -optimierung 33111.5 Klassische flüssigchromatographische Analytik 33211.6 Schnelle (meist zweite) Dimension der multidimensionalen Chromatographie 33211.7 Trennung von (Bio)polymeren 33311.8 Prozessanalysentechnik (PAT) 334Literatur 33412 Gerätehersteller berichten 33512.1 Agilent Technologies, Waldbronn 335J. TrafkowskiLiteratur 34512.2 Shimadzu, Duisburg 346B.-T. Erxleben12.3 Thermo Fisher Scientific, Germering 352F. Steiner12.3.1 Anforderungen an das gesamte System und wie die Erfahrung gelehrt hat diese zu meistern 35212.3.2 Die Eluentenförderungseinheit, weit mehr als eine Hochdruckpumpe 35712.3.3 Der Probengeber für das robuste Ausführen ultrapräziser Analysen, auch im Hochdurchsatz 35812.3.4 Neue Wege der Säulenthermostatisierung für die beste Trennleistung und Methodenübertragbarkeit 36012.3.5 Auch eine exzellente ultraschnelle Trennung muss von einem Detektor aufgezeichnet werden 36112.3.6 2D-LC zur Steigerung der Peakkapazität und andere Wege zu diesem Ziel sowie zur Steigerung der Produktivität 364Über die Autoren 367Index 371