Der Gradient in der HPLC für Anwender

Stavros Kromidas wurde nach langjähriger Tätigkeit im Verkauf von Waters Chromatography Inhaber und Geschäftsführer der Novia GmbH, später selbständiger Berater. Der promovierte Chemiker arbeitet seit 1978 auf dem Gebiet der HPLC und hat seit 1984 zahlreiche Trainingskurse und Workshops geleitet. Er ist Autor einer regelmäßigen HPLC-Kolumne in der Zeitschrift 'Labo' sowie einer Reihe außerordentlich erfolgreicher Bücher.

• Vorwort ixZum Aufbau des Buches xiZu den Autoren xiiiBeitragsautoren xviiTeil 1 Die Grundsätze der Gradientenelution 11 Aspekte der Gradienten-Optimierung 3Stavros Kromidas1.1 Einführung 31.2 Besonderheiten des Gradienten 31.3 Einige chromatographische Größen und Formeln 51.4 Nachweisgrenze, Peakkapazität, Auflösung – Möglichkeiten der Optimierung 81.4.1 Nachweisgrenze 81.4.2 Peakkapazität und Auflösung 101.5 Gradienten-„Mythen“ 141.6 Beispiele zur Optimierung von Gradientenläufen: ausreichende Auflösung in einer adäquaten Zeit 161.7 Gradienten-Aphorismen 382 Apparative Einflüsse auf die Qualität von Gradienten-Methoden und deren Übertragung zwischen unterschiedlichen Geräten 43Frank Steiner2.1 Arten der technischen Umsetzung der Gradientenelution und die jeweiligen Charakteristika 432.1.1 Die niederdruckseitige und die hochdruckseitige Gradientenerzeugung – Zwei technisch grundlegend verschiedene Prinzipien 432.1.2 Die Rolle der Mischvorrichtung bei HPG- und LPG-Systemen vor dem Hintergrund der verschiedenen Prinzipien der Gradientenformung 452.1.3 Die Arbeitsweise von Mischvorrichtungen und die systematische Charakterisierung von deren Effektivität 492.1.4 Auswirkungen der Volumenkontraktion beim Mischen von Wasser und organischen Lösemitteln bei Gradientensystemen 622.1.5 Auswirkungen kleinster Leckraten von Pumpenköpfen bei sensiblen Applikationen und HPG-Synchronisierungs-Techniken zu deren Korrektur 682.2 Die Bestimmung und Bedeutung des Gradientenverzögerungsvolumens der Apparatur 702.2.1 Die Bestimmung des GDV und seine Abhängigkeit von den Betriebsbedingungen des Systems 712.2.2 Der Einfluss des GDV auf die chromatographischen Ergebnisse 822.2.3 Möglichkeiten der GDV-Beeinflussung und seiner Auswirkung durch den Anwender 832.3 Die Übertragung von Gradientenmethoden zwischen unterschiedlichen HPLC-Systemen 862.3.1 Praktische Tipps zum Umgang mit abweichenden GDVs und Gegenmaßnahmen 862.3.2 Was ist bezüglich Druckäbhangigkeit des GDV zu beachten? 892.3.3 Auswirkung einer zu großen Elutionsstärke des Probelösemittels im schwachen Laufmittel des Gradientenstarts 912.4 Einfluss von Schwankungen der Eluentenzusammensetzung auf die Qualität der Detektion 942.4.1 Einfluss eines Referenzkanals auf die Basislinie bei den Diodenarray-Detektoren 952.4.2 Die spezielle Herausforderung bei Methoden mit UV-absorbierenden retardierten Additiven wie TFA (Trifluoressigsäure) in der mobile Phase 962.5 Weitere Arten der praktischen Anwendung von Gradientensystemen in der HPLC 1032.5.1 Alternative und kombinierte Gradienten-Modi in der HPLC 1032.5.2 Vorteile bei der Umsetzung isokratischer Methoden mit Gradientenapparaturen 1042.5.3 Nutzung von Gradientensystemen bei der Methodenentwicklung und Methodenoptimierung 1063 Optimierung einer „Reversed-Phase“-Gradiententrennung mit EXCEL 111Hans-Joachim KussTeil 2 Die Spezifika des Gradienten in einzelnen Trennmodi 1194 Die Gradientelution ionischer Verbindungen 121Joachim Weiss4.1 Einführung 1214.2 Theoretische Aspekte 1224.3 Gradientenarten in der Ionenchromatographie 1244.4 Wahl des Eluenten 1284.4.1 Möglichkeiten zur Optimierung von Konzentrationsgradienten 1344.5 Gradientelution von Anionen an Anionenaustauschern 1354.6 Gradientelution von Kationen an Kationenaustauschern 1464.6.1 pH-Gradienten für die Trennung monoklonaler Antikörper 1544.7 Gradientelution von Anionen und Kationen an Mixed-mode-Phasen 1605 Der Gradient in der Biochromatographie 173Oliver Genz5.1 Biomoleküle 1735.2 Biochromatographie 1735.3 Der Gradient in der Biochromatographie 1745.3.1 Ein Gradient, den man unbedingt vermeiden sollte 1755.4 Gradienten bei unterschiedlichen Biochromatographietechniken 1765.4.1 Gelfiltration, Size-Exclusion-Chromatography (SEC) 1765.4.2 Ionenaustauschchromatographie 1775.4.3 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) 1815.4.4 Umkehrphasenchromatographie von Biomolekülen 1835.4.5 Affinitätschromatographie (AC) 1845.5 Zusammenfassung 1866 Spezifika der Gradientenelution in der HILIC 187Thomas Letzel7 Spezifika der Gradientenelution in der SFC 197Stefan Bieber und Thomas Letzel7.1 Arten von Gradienten in der SFC 1977.1.1 Lösungsmittelgradienten 1977.1.2 Druckgradienten 1997.1.3 Temperaturgradienten 1997.2 Effekte von Gradienten 2008 Der Gradient in LC-MS-Messungen 203Markus M. Martin8.1 Bedeutung der Gradientelution für LC-MS 2038.2 Technische Aspekte des Einsatzes von Gradientelution zur LC-MS-Analytik 2078.2.1 Technische Einflüsse der LC-Anlage: Systemdispersion, Proportionierungspräzision und ihre Bedeutung für MS-Messungen 2078.2.2 Technische Einflüsse des Massenspektrometers: der LC-Gradient und die Signalerzeugung im MS 2128.2.3 Quantifizierung im Massenspektrometer innerhalb einer Gradientelution: Matrixeinflüsse und ihre Kompensation 2198.2.4 MS-Auslastung in der Gradientelution – Säulenäquilibrierung als Durchsatzvernichter 2228.2.5 Gradientenverzögerung, Flussrate und Säulendimension – wieviel hilft Downsizing bei Gradiententrennungen in der LC-MS? 2248.3 Fazit 2278.4 Abkürzungen 2279 Zusätzliche Werkzeuge zur Methodenverbesserung: Fluss- und Temperaturgradienten 231Egidijus Machtejevas9.1 Einleitung 2319.2 Temperaturgradienten 2319.3 Flussgradienten 2329.3.1 Kombination von Fluss- und Temperaturgradienten 2339.3.2 Fallbeispiele 2339.4 Schlussfolgerung 236Stichwortverzeichnis 239

"Neun Autoren haben bei der Entstehung dieses umfangreichen Werkes mitgewirkt. Sie kennen sich sowohl in der Praxis als auch in der Theorie der Gradientenelution bestens aus."ChemieXtra