Molekulare Diagnostik

Dr. Frank Thiemann ist Diplombiologe. Nach dem Studium der Biologie an der Universität Münster folgte ein Forschungsaufenthalt am Institut für Genetik der Universität zu Köln, den er 1995 mit der Promotion abschloss. Von 1996 bis 2013 leitete Frank Thiemann das molekularbiologische Labor des MVZ für Laboratoriumsmedizin in Münster. Sein besonderes Interesse galt der Standardisierung und der Qualitätskontrolle molekularbiologischer Testverfahren. Frank Thiemann war außerdem Referent für die Bildungsgesellschaft des Deutschen Verbandes der Technischen Assistenten (DVTA). Seit 2013 ist er als Senior Manager für die wissenschaftliche Produktentwicklung bei der sorbion GmbH & Co. KG verantwortlich. Prof. Dr. Paul Cullen ist Facharzt für Innere Medizin und Laboratoriumsmedizin sowie Klinischer Chemiker und Diplom-Biochemiker. Sein Staatsexamen absolvierte er 1983 am University College Dublin. Paul Cullen promovierte 1988 an der Medizinischen Hochschule Hannover und habilitierte sich 1998 für das Fach Laboratoriumsmedizin am Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin der Universität Münster. Derzeit leitet Paul Cullen das MVZ Medizinisches Labor Münster GbR Dr. Löer, Prof. Cullen und Kollegen und ist außerplanmäßiger Professor für Medizin an der Universität Münster. Seine Forschungsgebiete sind Arteriosklerose und Fettstoffwechsel. Paul Cullen ist Gründungsmitglied der Arbeitsgruppe Molekulare- und Chipdiagnostik der Vereinten Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin. Dr. med. Hanns-Georg Klein ist Facharzt für Laboratoriumsmedizin mit der Zusatzbezeichnung Medizinische Genetik. Er studierte Humanmedizin in Erlangen und München und promovierte an der Frauenklinik Erlangen. Während eines dreijährigen Forschungsaufenthalts als Stipendiat der Deutschen Forschungsgemeinschaft und im Rahmen eines Fogarty Fellowships am National Heart, Lung and Blood Institute in Bethesda beschäftigte er sich mit der Genetik von Fettstoffwechselstörungen. Nach seiner Rückkehr war er in München am Institut für Klinische Chemie des Klinikums Großhadern tätig und leitete ein DFG-Projekt. 1998 gründete er das Labor für Medizinische Genetik Dr. Klein (heute MVZ Martinsried), 2001 die IMGM Laboratories GmbH. Hanns-Georg Klein ist u.a. Vorsitzender der AG Genomics der DGKL, Fachredakteur der Zeitschrift für Laboratoriumsmedizin, Mitglied in mehreren medizinischen Fachgesellschaften und unterrichtet an der Universität München im Fach Klinische Chemie.

• Vorwort zur 1. Auflage XIII Vorwort zur 2. Auflage XVAutorenliste XVIIGlossar XXIEinführung 1Teil I Allgemeine Grundlagen und Präanalytik 31 Grundlagen der molekularen Diagnostik 5Frank Thiemann1.1 Die DNA 51.2 Die RNA 91.3 DNA-Replikation 121.4 Das Gen 131.5 Genomorganisation bei Prokaryonten 141.6 Genomorganisation bei Eukaryonten 141.7 Die Proteinbiosynthese 161.7.1 Die Transkription 161.7.2 Die Translation 211.8 Grundbegriffe in der molekularen Diagnostik 301.8.1 Inzidenz 301.8.2 Prävalenz 301.8.3 Mortalität 311.8.4 Letalität 311.8.5 Goldstandard 311.8.6 Richtigkeit und Präzision 311.8.7 Sensitivität und Spezifität 321.8.8 Prädiktiver Wert 342 Präanalytik in der molekularen Diagnostik 37Frank Thiemann2.1 Administrative Maßnahmen 372.2 Probengewinnung 382.2.1 Zeitpunkt der Probengewinnung 392.2.2 Proben- und Transportröhrchen 412.3 Hinweise zu Transport und Verpackung 452.3.1 Kategorie A UN 2814 452.3.2 Kategorie B UN 3373 462.3.3 Freigestellte medizinische Proben 462.4 Präanalytische Schritte im Labor 462.4.1 Räumliche Voraussetzungen 472.4.2 Vollautomatische Analysesysteme 49Teil II Methoden 513 Isolierung von Nukleinsäuren 53Edgar Setzke und Hans Nitschko3.1 Einleitung 533.2 Die Probenvorbereitung 533.3 Der Zellaufschluss in Abhängigkeit des Probenmaterials und der zu isolierenden Nukleinsäure 553.4 Isolierung von DNA 563.4.1 Phenol/Chloroform-Extraktion 563.4.2 Silikamembranen oder mit Silika beschichtete Oberflächen (magnetische Partikel) 573.4.3 Anionenaustauscher-Säulen 613.5 Isolierung von RNA 633.5.1 Isolierung von Virus-RNA 633.5.2 Isolierung von zellulärer RNA 643.6 Manuelle und automatisierte Systeme zur Nukleinsäureisolierung in der molekularen Diagnostik 653.6.1 Manuelle Extraktionssysteme 663.6.2 Automatisierte Extraktionssysteme 683.7 Überprüfung der Menge, Reinheit und Qualität von RNA und DNA 723.7.1 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäure [Menge/(Reinheit)] 733.7.2 Abschätzung der DNA-Menge durch Gelelektrophorese und Anfärbung mit Ethidiumbromid oder anderen Farbstoffen [Menge/(Qualität)] 733.7.3 Bioanalyzer [Menge/Qualität] 743.7.4 Spotmethode [Menge] 753.7.5 DNA/Zellzahlbestimmung durch PCR genomischer Sequenzen [Menge] 763.8 Lagerung der isolierten RNA/DNA 773.8.1 Lagerung von Standards 784 Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren 79Stefan Lorkowski, Ofert Landt, Carsten Tiemann, Michael Weizenegger, Ulrich Eigner, Charlotte Sager, Frank Thiemann und Paul M. Cullen4.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 794.1.1 Geschichtlicher Hintergrund 794.1.2 Das Prinzip der PCR 804.1.3 Die Komponenten der PCR 854.1.4 Anforderungen an das Ausgangsmaterial 894.1.5 PCR-Zusätze 914.1.6 Weitere PCR-Methoden 924.2 Entwicklung (Design) von Real time-PCR Assays: Primerauswahl und Sonden 994.2.1 Grundsätze 1004.2.2 Primer 1004.2.3 Sonden 1024.2.4 Farbstoffe und Multiplex-PCR 1034.2.5 Kriterien der Leistungsbewertung 1034.3 Detektion von PCR-Produkten 1064.3.1 Agarosegelelektrophorese 1064.3.2 Chip-Elektrophorese (Lab-on-a-Chip) 1094.3.3 PCR-ELISA und partikelbasierte Detektion 1104.3.4 Reverse Hybridisierung 1144.3.5 HyBeacon-Technologie 1184.4 Real time-PCR 1214.4.1 Interkalierende Farbstoffe (SYBR) 1214.4.2 TaqMan-Sonden 1224.4.3 Dark Quencher (BHQ, black hole quencher) 1234.4.4 MGB-Sonden (minor grove binder) 1234.4.5 Molecular Beacons 1244.4.6 Modifizierte Oligonukleotidbausteine 1244.4.7 Hybridisierungsproben 1254.4.8 Scorpion-Primer 1264.4.9 Schmelzpunktanalytik 1274.4.10 High Resolution Melt (HRM) 1284.4.11 Miniaturisierte Technik 1294.4.12 Quantitative PCR 1294.4.13 Absolute Quantifizierung 1304.4.14 Relative Quantifizierung 1324.4.15 Dual Target 1334.4.16 Digitale PCR (dPCR) 1344.5 Multiplex-PCR 1354.5.1 Mit „Dual Priming“-Oligonukleotiden der Multiplex-PCR auf die Sprünge helfen 1374.5.2 MLPA als Werkzeug für die Multiplex-PCR 1404.5.3 Wenn es etwas mehr sein soll: Multiplex-PCR mit Luminex 1444.5.4 Multiplex-PCR: Die Qual der Wahl 1494.6 Weitere Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren 1494.6.1 DNA-Sonden-Assays (Gensonden) 1504.6.2 Transcription-Mediated Amplifikation (TMA) 1504.6.3 Hybridization Protection Assay (HPA) 1534.6.4 Nucleic Acid Sequence based Amplifikation (NASBA) 1544.6.5 Strand-Displacement Amplification (SDA) 1564.6.6 Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) 1584.6.7 Massenspektrometrie als neue Option 1584.6.8 Das Prinzip 1624.6.9 Massenspektrometrie im PCR-Labor 1644.6.10 Die Target-Regionen und ihre Analyse 1674.6.10.1 Der Einsatz im Routinelabor 1694.7 DNA-Mikroarrays 1705 DNA-Sequenzierung 173Andre Frontzek5.1 DNA-Sequenzierung nach Sanger 1735.2 Pyrosequenzierung 1805.3 Minisequenzierung 1835.4 Sequenzierung mit Mikroarrays 1855.5 Sequenzierung – die nächste Generation 1865.6 Die Zukunft der Sequenzierung 191Teil III Indikationen 1936 Indikationen für die molekulare Diagnostik 195Holger F. Rabenau, Udo Reischl, Uwe Lang, Matthias Aymanns, Tim Hagedorn, Kim Koop, Jana Schröder und Andreas Uekötter6.1 Erkrankungen durch Viren 1986.2 Erkrankungen durch Bakterien, Pilze und Parasiten 2216.3 Molekulare Methoden in der Krankenhaushygiene 2276.3.1 Bedeutung der Krankenhaushygiene in Deutschland 2276.3.2 Gesetzliche Rahmenbedingungen 2286.3.3 Molekularbiologische Erregersuchtests 2296.3.4 Molekulare Typisierungsmethoden in der Krankenhaushygiene 2317 Humangenetik 235Hanns-Georg Klein, Imma Rost, Christoph Marschall, Karin Mayer, Sebastian Eck, Ina Vogl, Christina Sofeso, Camilla Ladinig, Wolfgang Rupprecht, Paul M. Cullen, Brigitte Welling, Uwe Heinrich, Annett Wagner, Tanja Hinrichsen, Thomas Harasim und Birgit Busse7.1 Klinische Genetik 2367.1.1 Gesetzliche Rahmenbedingungen 2367.1.2 Genetische Beratung 2377.1.3 Erbgänge 2397.2 Molekulargenetik 2417.2.1 Monogene Erkrankungen 2417.2.2 Next Generation Sequencing in der Diagnostik 2477.3 Prädispositionsdiagnostik 2507.3.1 Prädispositionsdiagnostik für polygene Erkrankungen 2517.4 Klassische und molekulare Zytogenetik 2617.4.1 Postnataldiagnostik 2617.4.2 Pränataldiagnostik 2677.4.3 Tumorzytogenetik 2687.4.4 Molekulare Zytogenetik 2717.5 Nicht invasiver Pränataltest (NIPT) 2767.6 Reproduktionsgenetik 2787.6.1 Polkörperdiagnostik – Präimplantationsdiagnostik 2787.7 Pharmakogenetik 2827.7.1 Verstoffwechselung von Arzneimitteln 2837.7.2 Transportproteine 2857.7.3 Pharmakogenetik in der Routinediagnostik 2857.8 Abstammungsanalysen 2867.8.1 Gesetzliche Grundlagen 2887.8.2 Weitere Anwendungen von Mikrosatellitenanalysen 2888 Immungenetik und Transfusionsmedizin 291Hannah Rabenstein, Kristin Kipper, Barbara Bangol und Kaimo Hirv8.1 MHC-Komplex und HLA-System 2918.1.1 Klinische Bedeutung der HLA-Typisierung 2928.1.2 Methodische Aspekte der HLA-Typisierung 2958.2 Primäre Immundefekterkrankungen 2988.3 Hereditäre periodische Fiebersyndrome 2999 Molekulare Onkologie und Pathologie 301Tanja Hinrichsen, Stefanie Kühner, Oliver Wachter und Barbara Dockhorn-Dworniczak9.1 Leukämien 3029.1.1 Ablauf einer genetischen Diagnostik am Beispiel der chronischen myeloischen Leukämie (CML) 3039.2 Solide Tumore 3079.2.1 Kolorektales Karzinom (KRK) 308Teil IV Qualität 31310 Qualitätssicherung in der molekularen Diagnostik 315Holger F. Rabenau und Udo Reischl10.1 Präanalytik 31710.1.1 Labortechnische und -organistorische Voraussetzungen 31710.1.2 Kontrollen 31710.2 Validierungen von molekularbiologischen Verfahren 31810.3 NAT-spezifische Aspekte der Qualitätssicherung – RiLiBÄK 2013 321Gesetze und Normen zur Regelung der molekularen Labordiagnostik im deutschsprachigen Raum 323Paul M. Cullen und Michael NeumaierEU-Richtlinie 98/79/EG über In vitro-Diagnostik 323Besondere Bedeutung der EU-Richtlinie für die Molekulardiagnostik 325Regelung von Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT) bei der Diagnose von Infektionskrankheiten 325Das deutsche Gendiagnostikgesetz 325Aufbau und Inhalt des Gendiagnostikgesetzes 326Was vom Gendiagnostikgesetz nicht geregelt wird 326Was vom Gendiagnostikgesetz geregelt wird 326Anwendung des Gendiagnostikgesetzes – was in der täglichen Praxis beachtet werden muss 327Gendiagnostikgesetz: Kritik, Interpretation und Modifikationen 333Weiterführende Literatur 337Index 341

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