Elektrophorese leicht gemacht

Reiner Westermeier war nach seiner Promotion und Post-Doc Zeit an der Technischen Universität München 30 Jahre lang als Spezialist für Elektrophorese bei führenden Firmen für Bioanalytik- und Biotechnologie tätig. Sein Aufgabengebiet umfasste die Entwicklung neuer Methoden und Geräte, das Schreiben von wissenschaftlichen Artikeln und Anleitungen, Problemlösungen beim Anwender, die Durchführung von Seminaren und Praxis-Kursen auf dem Gebiet der Elektrophorese und der Proteomik, sowie das weltweite Halten von Vorträgen. Er ist Herausgeber und Autor mehrerer erfolgreicher Bücher, wie z.B Electrophoresis in Practice (in deutsch und in englisch), Proteomics in Practice, und Difference Gel Electrophoresis. Heute berät er Firmen aus dem Umfeld der Elektrophorese und gibt Schulungen zum Thema.

• Geleitwort XV Vorwort XVIIVorwort zur ersten Auflage XIXAbkürzungen XXITeil I Grundlagen 11 Elektrophorese 71.1 Allgemeines 71.1.1 Elektrophoresen in freier Lösung 71.1.2 Elektrophoresen in stabilisierenden Medien 111.1.3 Gelelektrophorese 121.1.4 Stromversorger 201.1.5 Trennkammern 201.2 Elektrophoresen in nicht restriktiven Gelen 251.2.1 Agarosegelelektrophorese 251.2.2 Polyacrylamidgelelektrophorese von niedermolekularen Substanzen 271.3 Elektrophorese in restriktiven Gelen 281.3.1 Der Ferguson-Plot 281.3.2 Agarosegelelektrophorese 291.3.3 Polyacrylamidgelelektrophorese von Nukleinsäuren 311.3.4 Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen 34Literatur 482 Isotachophorese 532.1 Wanderung mit gleicher Geschwindigkeit 552.2 Trennung der Substanzen in der Form einer Kette ion train 552.3 Zonenschärfungseffekt 552.4 Konzentrationsregulierungseffekt 56Literatur 573 Isoelektrische Fokussierung 593.1 Prinzip 593.2 Gele für die IEF 613.2.1 Polyacrylamidgele 613.2.2 Agarosegele 633.3 Temperatur 643.4 Kontrolle des pH-Gradienten 643.5 Arten von pH-Gradienten 653.5.1 Freie Trägerampholyten 653.5.2 Immobilisierte pH-Gradienten 693.6 Präparative Isoelektrische Fokussierung 723.7 Titrationskurvenanalyse 73Literatur 754 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 794.1 IEF in IPG-Streifen 794.1.1 Streifengeometrie 804.1.2 pH-Gradienten 804.1.3 Einfluss von Salzen 804.1.4 Basische pH-Gradienten 814.1.5 Rehydratisieren von IPG-Streifen 824.1.6 Probenaufgabe 854.1.7 IEF-Bedingungen 874.1.8 Instrumentierung 884.2 SDS-PAGE 904.2.1 Äquilibrieren der IPG-Streifen 904.2.2 TechnischeKonzepte für die zweite Dimension (SDS-PAGE) 914.2.3 Geltypen 934.2.4 Gelherstellung 944.2.5 Durchführung der SDS-Elektrophorese 974.3 Proteomik 99Literatur 995 Proteinprobenvorbereitung 1035.1 Proteinquantifizierungsmethoden 1035.2 Vorbereitung von nativen Proben 1045.3 Proben für die SDS-Elektrophorese 1055.3.1 SDS-Behandlung 1055.3.2 Aufreinigung und Proteinanreicherung 1095.4 Proben für die hochauflösende 2-D-PAGE 1105.4.1 Waschen von Zellen 1115.4.2 Zellaufschluss 111Inhaltsverzeichnis VII5.4.3 Probennahme und -aufbewahrung 1125.4.4 Inaktivierung von Proteasen 1145.4.5 Inaktivierung von Phosphatasen 1145.4.6 Alkalische Bedingungen 1145.4.7 Entfernung von störenden Substanzen 1155.4.8 Vorfraktionierung 1165.4.9 Spezialfall: Pflanzenproteine 117Literatur 1186 Proteindetektion 1216.1 Fixierung 1216.1.1 IEF-Gele 1216.1.2 Agarosegele 1226.1.3 SDS-Polyacrylamidgele 1226.2 Färbungen nach der Elektrophorese 1226.2.1 Organische Farbstoffe 1226.2.2 Silberfärbung 1236.2.3 Negativfärbung 1256.2.4 Fluoreszenzfärbung 1266.2.5 Spezifische Detektion 1276.2.6 Visualisierung ohne Färbung 1286.3 Proteinmarkierung 1296.3.1 Proteinmarkierung mit Fluorophoren 1296.3.2 Radioaktive Markierung von lebenden Zellen 1306.4 Differenzgelelektrophorese (DIGE) 1306.4.1 Minimal-Lysinmarkierung 1316.4.2 Sättigung-Cysteinmarkierung 1336.4.3 Der interne Standard 1346.4.4 Planung eines Experiments 1346.4.5 Die wichtigsten Vorteile von 2-D-DIGE 1346.4.6 Vergleichende Fluoreszenzgelelektrophorese 1356.5 Bildaufzeichnung, Bildanalyse, Spotpicken 1366.5.1 Gehaltsbestimmungen 1366.5.2 Bildaufzeichnungssysteme 1386.5.3 Bildanalyse 1416.5.4 Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen 144Literatur 1467 Blotting 1517.1 Transfermethoden 1517.1.1 Diffusions-Blotting 1517.1.2 Kapillar-Blotting 1527.1.3 Press-Blotting 1537.1.4 Vakuum-Blotting 1537.1.5 Elektrophoretisches Blotting 1547.2 Blotmembranen 1577.3 Puffer für elektrophoretische Transfers 1587.3.1 Proteine 1587.3.2 Nukleinsäuren 1607.4 Allgemeine Anfärbung 1607.5 Blockieren 1617.6 Spezialdetektion 1617.6.1 Hybridisierung 1617.6.2 Enzym-Blotting 1627.6.3 Immun-Blotting 1627.6.4 Lektin-Blotting 1657.6.5 Stripping,Mehrfachanalyse 1667.6.6 Doppel-Blotting 1667.7 Proteinsequenzierung 1667.8 Transferprobleme 1667.9 Elektroelution von Proteinen aus Gelen 167Literatur 169Teil II Praktische Methodenanleitungen – Ausrüstung und Methoden 173Methode 1 PAGE von Farbstoffen 183M1.1 Probenvorbereitung 183M1.2 Stammlösungen 183M1.3 Vorbereitung der Gießkassette 184M1.3.1 Dichtung 184M1.3.2 Slotformer 184M1.3.3 Zusammenbau der Gießkassette 185M1.4 Gießen der ultradünnen Gele 187M1.5 Elektrophoretische Trennung 187M1.5.1 Entnahme des Gels aus der Kassette 187Methode 2 Agarose- und Immunelektrophoresen 191M2.1 Probenvorbereitung 191M2.2 Stammlösungen 192M2.3 Herstellung der Gele 192M2.3.1 Agarosegelelektrophorese 192M2.3.2 Immunelektrophoresegele 194M2.4 Elektrophoresen 198M2.4.1 Grabar-Williams-Technik 199M2.4.2 Laurell-Technik 199M2.5 Proteinnachweis 200M2.5.1 Coomassie-Färbung (Agaroseelektrophorese) 200M2.5.2 Immunfixation der Agaroseelektrophorese 200M2.5.3 Coomassie-Färbung (Immunelektrophoresen) 201M2.5.4 Silberfärbung 202Literatur 202Methode 3 Titrationskurvenanalyse 203M3.1 Probenvorbereitung 203M3.2 Stammlösungen 203M3.3 Herstellung der leeren Gele 204M3.3.1 Vorbereitung der Gießform 204M3.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 205M3.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 207M3.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 207M3.4 Titrationskurvenelektrophorese 209M3.4.1 Erzeugung des pH-Gradienten (Lauf ohne Probe) 209M3.4.2 Nativelektrophorese im pH-Spektrum 210M3.5 Coomassie- und Silberfärbung 210M3.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 210M3.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 211M3.5.3 Fünf-Minuten-Silberfärbung getrockneter Gele 211M3.6 Interpretation der Kurven 212Literatur 214Methode 4 Native PAGE in amphoteren Puffern 215M4.1 Probenvorbereitung 216M4.2 Stammlösungen 217M4.3 Herstellung der leeren Gele 218M4.3.1 Slotformer 218M4.3.2 Zusammenbau der Gießkassette 219M4.3.3 Polymerisationslösungen 220M4.3.4 Befüllen der gekühlten Gelgießkassette 221M4.3.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 221M4.3.6 Waschen und Trocknen der Gele 222M4.3.7 Quellen des Gels im amphoteren Puffer 222M4.4 Elektrophorese 224M4.5 Coomassie- und Silberfärbung 226M4.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 226M4.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 227M4.5.3 Fünf-Minuten Silberfärbung getrockneter Gele 227Literatur 228Methode 5 Agarosegel-IEF 231M5.1 Probenvorbereitung 231M5.2 Herstellung des Agarosegels 232M5.2.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 232M5.2.2 Zusammenbau der Gelkassette 232M5.2.3 Herstellung der Agaroselösung (0,8% Agarose) 233M5.3 Isoelektrische Fokussierung 235M5.3.1 Herstellung der Elektrodenlösungen 235M5.4 Proteinnachweis 237M5.4.1 Coomassie-Blau-Färbung 237M5.4.2 Immunfixation 237M5.4.3 Silberfärbung 238Literatur 239Methode 6 PAGIEF in rehydratisierten Gelen 241M6.1 Probenvorbereitung 241M6.2 Stammlösungen 241M6.3 Herstellung der leeren Gele 242M6.3.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 242M6.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 242M6.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 243M6.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 244M6.3.5 Waschen des Gels 244M6.3.6 Trocknen des Gels 245M6.4 Isoelektrische Fokussierung 245M6.4.1 Rehydratisierlösung (Servalyt™, Pharmalyte™) 245M6.4.2 Quellen des Gels 245M6.4.3 Proteintrennung 246M6.4.4 Probenaufgabe 247M6.5 Coomassie- und Silberfärbung 248M6.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 248M6.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 249M6.5.3 Die empfindlichste Silberfärbung für die IEF 249M6.6 Methodischer Ausblick 251Literatur 253Methode 7 Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese 255M7.1 Probenvorbereitung 255M7.1.1 Nicht reduzierende SDS-Behandlung 255M7.1.2 Reduzierende SDS-Behandlung 256M7.1.3 Reduzierende SDS-Behandlungmit Alkylierung 257M7.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 257M7.2.1 Markierung 257M7.2.2 Detektion 258M7.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 258M7.4 Vorbereitung der Gießkassette 259M7.4.1 Herstellen des Slotformers 259M7.4.2 Zusammenbau der Gießkassette 260M7.5 Gradienten-Gel 261M7.5.1 Gießen des Gradientengels 261M7.6 Elektrophorese 265M7.6.1 Vorbereitung der Trennkammer 265M7.6.2 Entnahme des Gels aus der Kassette 265M7.6.3 Platzierung auf der Kühlplatte 265M7.6.4 Elektrophorese 267M7.7 Coomassie- und Silberfärbung 267M7.7.1 Heiße Coomassie-Färbung 267M7.7.2 Kolloidalfärbung 268M7.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 269M7.7.4 Silberfärbung 270M7.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 270M7.8 Blotting 271M7.9 Methodischer Ausblick 272M7.9.1 SDS-Elektrophorese in gewaschenen und rehydratisierten Gelen 272M7.9.2 Trennung von Peptiden 273Literatur 274Methode 8 Vertikale PAGE 275M8.1 Probenvorbereitung und Proteinmarkierung 276M8.2 Stammlösungen für die SDS-PAGE 277M8.3 Gießen von Einzelgelen 278M8.3.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 278M8.3.2 Gradientengele 279M8.4 Gießen vonMehrfachgelen 281M8.4.1 Multiple diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 282M8.4.2 Multiple SDS-Polyacrylamidgradientengele 283M8.5 Elektrophorese 286M8.6 SDS-Elektrophorese von niedermolekularen Peptiden 288M8.6.1 Stammlösungen 288M8.7 Zweidimensional-Elektrophorese 289M8.8 DNA-Elektrophorese 290M8.9 Langzeitstabile Gele 291M8.10 Proteindetektion 291M8.11 Präparieren von Glasplatten mit Bind-Silan 292M8.11.1 Beschichten einer Glasplatte mit Bind-Silan 292M8.11.2 Entfernen von Gel und Bind-Silan von einer Glasplatte 293Literatur 293Methode 9 Blau-Nativ-PAGE 295M9.1 Solubilisierung 295M9.2 Stammlösungen 296M9.3 Gießen der Gele 297M9.4 Elektrophorese 299Literatur 300Methode 10 Semidry-Blotting von Proteinen 301M10.1 Transferpuffer 303M10.1.1 Kontinuierliches Puffersystem 303M10.1.2 Diskontinuierliches Puffersystem 303M10.1.3 Transfers aus Agarosegelen 304M10.2 Technische Durchführung 304M10.2.1 Gele ohne Trägerfolie 305M10.2.2 Trägerfoliengebundene Gele 306M10.2.3 Bei Verwendung von Nitrocellulose (NC)-Membran 306M10.2.4 Bei Verwendung einer PVDF-Membran 307M10.2.5 Proteintransfer aus den abgeschnittenen Gelen 308M10.3 Färbung von Blotfolien 309M10.3.1 Amidoschwarzfärbung 309M10.3.2 Reversible Färbung 309M10.3.3 Indian-Ink-Färbung 310Literatur 311Methode 11 IEF im immobilisierten pH-Gradienten 313M11.1 Probenvorbereitung 314M11.2 Stammlösungen 314M11.3 Immobilinerezepturen 315M11.3.1 Maßgeschneiderte pH-Gradienten 315M11.4 Vorbereitung der Gießkassette 318M11.4.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 318M11.4.2 Zusammenbau der Gelkassette 319M11.5 Herstellung der pH-Gradientengele 320M11.5.1 Gießen des Gradienten 321M11.6 Isoelektrische Fokussierung 327M11.6.1 Probenaufgabe 327M11.6.2 Elektrodenlösungen 328M11.6.3 Fokussierungsbedingungen 328M11.6.4 Messung des pH-Gradienten 329M11.7 Coomassie- und Silberfärbung 329M11.7.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 329M11.7.2 Acid-Violet-17-Färbung 330M11.8 Strategien der IPG-Fokussierung 331Literatur 332Methode 12 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 333M12.1 Probenvorbereitung 334M12.1.1 Probenaufreinigung 335M12.1.2 Wichtige Hinweise zur kompletten Resolubilisierung der Pellets 335M12.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 338M12.2.1 Markierung einer Probe 338M12.2.2 Detektion 338M12.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 339M12.4 Gelherstellung 340M12.4.1 IPG-Streifen 340M12.5 SDS-Porengradientengele 344M12.6 Trennbedingungen 346M12.6.1 Erste Dimension (IPG-IEF) 346M12.6.2 Äquilibrieren 351M12.6.3 Zweite Dimension (SDS-Elektrophorese) 352M12.7 Proteindetektion 356M12.7.1 Färben von multiplen Gelen 356M12.7.2 Kolloidalfärbung 358M12.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 358M12.7.4 Silberfärbung 359M12.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 360Literatur 361Methode 13 Zweidimensional-Differenzgelelektrophorese (DIGE) 365M13.1 Planung eines Experiments 365M13.2 Probenvorbereitung 366M13.2.1 Solubilisierung von DIGE-Proben 366M13.2.2 Rekonstituierung der CyDyes 367M13.2.3 Für Minimalmarkierung der Lysine 367M13.2.4 Für Sättigungsmarkierung der Cysteine 368M13.3 DIGE-Markierung 368M13.3.1 Minimalmarkierung der Lysine 368M13.3.2 Sättigungsmarkierung der Cysteine 369M13.4 Vorbereitung für die Probenaufgabe auf die IPG-Streifen 371M13.5 Detektion der DIGE-Spots 371Literatur 372Methode 14 PAGE von DNA-Fragmenten 373M14.1 Stammlösungen 374M14.1.1 Puffersystem I (Tris-Acetat/Tris-Tricin) 374M14.1.2 Puffersystem II (Tris-Phosphat/TBE) 375M14.2 Herstellung der Gele 375M14.2.1 Vorbereitung der Gießkassette 375M14.2.2 Herstellen des Slotformers 376M14.2.3 Zusammenbau der Gießkassette 377M14.2.4 Befüllen der Gelgießkassetten 378M14.2.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 379M14.2.6 Waschen und Trocknen der Gele 379M14.3 Probenvorbereitung 379M14.3.1 PCR-Produkte generell 379M14.3.2 SSCP-Proben 380M14.4 Elektrophorese 381M14.4.1 Anquellen von gewaschenen und getrockneten Gelen 381M14.4.2 Vorbereitung der Elektrodendochte 383M14.4.3 Entnahme des Gels aus der Kassette 383M14.4.4 Platzierung auf der Kühlplatte 384M14.4.5 Probenaufgabe und Elektrophorese 385M14.5 Silberfärbung 386Anhang A Problemlösungen 389A.1 Häufige Fehler 389A.2 Isoelektrische Fokussierung 392A.2.1 PAGIEF mit Trägerampholyten 392A.2.2 Agarosegel-IEF mit Trägerampholyten 401A.2.3 Immobilisierte pH-Gradienten 406A.3 SDS-Elektrophorese 413A.3.1 Horizontale SDS PAGE 413A.3.2 Vertikale PAGE 422A.4 Zweidimensional-Elektrophorese 425A.5 Semidry-Blotting 433A.6 PAGE von DNA-Fragmenten 440Literatur 443Stichwortverzeichnis 445

"Trotz des Preises ist es ein empfehlenswertes Buch für all diejenigen, die viel mit diesen Techniken zu tun haben, und wissen, wie frustrierend es ist, Tage an Arbeit in eine Detektion gesteckt zu haben, ohne ein vernünftiges Ergebnis zu erzielen, aber auch, ohne zu wissen, warum."Fachschaft Medizin Universität Münster (01.02.2017) "Für Elektrophorese-affine Forscher lohnt sich die Anschaffung von Reiner Westermeiers 'Elektrophorese-Praxisbuch' definitiv."Laborjournal (23.02.2017)